通過微調底物結合口袋實現環氧化物水解酶的區域選擇性轉換，以合成(R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇
頂

分類：行業動態
發布時間：2024-12-10 13:04
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【概要描述】環氧化物水解酶（Epoxide hydrolase, EHs, EC3.3.2.-）普遍存在於(yu) 各種生命形式中，能特異性地水解外消旋環氧底物，並生成相應的手性1,2-二醇。

通過微調底物結合口袋實現環氧化物水解酶的區域選擇性轉換，以合成(R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇
頂

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環氧化物水解酶（Epoxide hydrolase, EHs, EC3.3.2.-）普遍存在於(yu) 各種生命形式中，能特異性地水解外消旋環氧底物，並生成相應的手性1,2-二醇（如圖1）。手性環氧化物和1,2-二醇是合成高價(jia) 值藥物的關(guan) 鍵中間體(ti) ，例如，(R)-苯基-1,2-乙二醇（(R)-PED）是合成芳基烷基胺鈣化劑(R)-(+)-NPS R-568的前體(ti) ，(S)-PED可用於(yu) 生產(chan) KDMSO抑製劑。然而，天然EHs對環氧化物底物的兩(liang) 種對映體(ti) 的區域選擇性普遍較差，且EHs的分子修飾能夠達到完全逆轉其區域選擇性的案例較少。

圖1. EHs對外消旋環氧化物的水解作用

因此，本文通過計算機輔助設計，對來自Rhodotorula paludigena JNU001的環氧化物水解酶(RpEH)的底物結合袋(SBP)內(nei) 特定殘基進行靶向突變。並研究了RpEH突變體(ti) 催化苯乙烯氧化物（SO）進行區域選擇性水解的工業(ye) 應用。此外，作者通過分子動力學（MD）模擬，初步解釋了RpEH-I194F對(S)-SO的區域選擇性逆轉的機製。

具體(ti) 的研究過程如下：

①RpEH對外消旋環氧化物(rac-SO)的區域選擇性水解作用

利用RpEH的濕細胞催化rac-SO進行水解反應，可生成(R)-苯基-1,2-乙二醇，轉化率為(wei) 93.6%，說明該酶對R構型產(chan) 物有立體(ti) 選擇性，產(chan) 物ee值為(wei) 67.8%。同時測定了(S)-和(R)-SO的區域選擇性係數α_S和β_R值（計算公式如下[1]）。結果表明，RpEH具有較高的β_R值（90.8%），對(S)-SO區域選擇性係數α_S值（77.0%）較低。

區域選擇性係數計算公式：

(S)-SO的區域選擇性係數用α_S和β_S表示，α_S=[R_p/(R_p+S_p)]×100%，α_S+β_S=100%；

(R)-SO的區域選擇性係數用α_R和β_R表示，α_R=[S_p/(R_p+S_p)]×100%，α_R+β_R=100%；

其中，R_p和S_p分別表示R型產(chan) 物和S型產(chan) 物的濃度。

②RpEH突變體的設計、構建及篩選

在本文中，將RpEH與底物(S)-SO對接，通過MD模擬獲得1000個對接構像，從中分析RpEH的SBP區域殘基和(S)-SO之間的相互作用頻率，頻率超過50%的候選突變殘基有Tyr331、Pro216、Ile194和Leu360。由於Tyr331是催化活性中心殘基，Pro216的剛性環狀結構對維持β-轉角穩定性有重要作用，因此最終選擇Ile194和Leu360進行定點突變。

將194和360位點的殘基分別替換為(wei) Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Asn、Val、Trp和Tyr，轉化至大腸杆菌BL21(DE3)中，而後將重組菌體(ti) 進行培養(yang) 、誘導表達。通過RpEH野生型(WT)及突變體(ti) 酶對rac-SO底物的水解反應，最終篩選到了2個(ge) 較優(you) 突變體(ti) RpEH-L360V和RpEH-L360F，比WT的水解活性分別提高了102%和114.4%（如圖2）。

圖2. RpEH野生型(WT)及突變體酶的水解活性

③RpEH突變體區域選擇性的研究

為了探究RpEH突變體對rac-SO的區域選擇性，在25℃下，利用RpEH突變體濕細胞對rac-SO進行12h水解，並測定了它們的區域選擇係數（α_S和β_R）。結果顯示，RpEH-L360V對底物rac-SO的轉化率高（c>99%），產物(R)-PED的eep值高達84.6%。值得關注的是，RpEH-I194F對rac-SO的水解生成了相反構型的產物(S)-PED（如表1，僅列出比WT活性高的突變體數據）。

表1. RpEH野生型(WT)及其突變體(ti) 對rac-SO的轉化率、

ee值和區域選擇性係數

（表格中帶負號的ee_p值表示生成的產物為S構型）

④突變體RpEH-I194F的區域選擇性逆轉機理

根據“近攻構象異構體（NAC）”理論， Asp的親核O原子與環氧化物的親電C_α或C_β之間的距離（dα或dβ）對於確定EH區域選擇性至關重要。因此，本文將底物(S)-SO對接到RpEH和RpEH-I194F的SBPs中，形成兩種不同的EH-環氧化物複合物，再通過MD模擬了底物與SBP殘基分子間相互作用時的構象變化。

結果表明，EH-環氧化物複合物RpEH-I194F-(S)-SO的平均dα值大於RpEH-(S)-SO，而dβ值小於RpEH-(S)-SO（如圖3），說明RpEH中的Asp190親核殘基優先攻擊(S)-SO的Cα，而RpEH-I194F則優先攻擊C_β。

圖3. RpEH（左）和RpEH-I194F（右）

分別與底物(S)-SO對接的複合物構象

RpEH-I194F攻擊原子的改變是因為(wei) 在RpEH-I194F-(S)-SO中，Ile194被Phe取代，改變了鄰近Trp191的構象，增加了其與(yu) (S)-SO的Pi-Pi相互作用的頻率，這些頻繁的分子間相互作用引起了(S)-SO的構象變化，使其Cβ原子更靠近親(qin) 核Asp190（如圖4），從(cong) 而逆轉RpEH-I194F的區域選擇性。

圖4. RpEH和RpEH-I194F與(yu) (S)-SO的

分子間相互作用力及底物構象變化

⑤突變體RpEH-L360V和RpEH-I194F的應用實例

由於(yu) 突變體(ti) RpEH-L360V具有較高的α_S值（96.9%），而RpEH-I194F具有較高的β_S值（98.8%），且均具有較高的催化活性，因此將這兩(liang) 個(ge) 突變體(ti) 分別應用於(yu) 底物(S)-1a的區域選擇性水解反應，以合成手性苯基-1,2-乙二醇（(R)-1b和(S)-1b），具體(ti) 反應路線如圖5。

圖5. RpEH-L360V和RpEH-I194F對

(S)-環氧化物1a水解的反應路線

同時，對突變體RpEH-L360V和RpEH-I194F的放大規模生產條件進行優化，最終得到的最佳反應條件如表2。RpEH突變體對底物的轉化率均達99%以上，獲得的產物ee值分別為97.2%和97.6%。

表2.RpEH-L360V和RpEH-I194F的最佳反應條件及結果

本文總結：本文通過對環氧化物水解酶(RpEH)的定點突變以調節突變體(ti) 的區域選擇性，最終篩選得到2個(ge) 突變體(ti) RpEH-L360V和RpEH-I194F，他們(men) 的催化活性高，且具有不同的區域選擇性。將RpEH-L360V和RpEH-I194F分別應用於(yu) (R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇的克級合成，均獲得了大於(yu) 99%轉化率。此外，本文還通過MD模擬初步分析了突變體(ti) RpEH-I194F區域選擇性逆轉的機製。