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通过微调底物结合口袋实现环氧化物水解酶的区域选择性转换以合成(R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇
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  • 分类行业动态
  • 发布时间2024-12-10 13:04
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【概要描述】环氧化物水解酶（Epoxide hydrolase, EHs, EC3.3.2.-）普遍存在于各种生命形式中能特异性地水解外消旋环氧底物并生成相应的手性1,2-二醇

通过微调底物结合口袋实现环氧化物水解酶的区域选择性转换以合成(R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇
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【概要描述】环氧化物水解酶（Epoxide hydrolase, EHs, EC3.3.2.-）普遍存在于各种生命形式中能特异性地水解外消旋环氧底物并生成相应的手性1,2-二醇

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环氧化物水解酶（Epoxide hydrolase, EHs, EC3.3.2.-）普遍存在于各种生命形式中能特异性地水解外消旋环氧底物并生成相应的手性1,2-二醇（如图1）手性环氧化物和1,2-二醇是合成高价值药物的关键中间体例如(R)-苯基-1,2-乙二醇（(R)-PED）是合成芳基烷基胺钙化剂(R)-(+)-NPS R-568的前体(S)-PED可用于生产KDMSO抑制剂然而天然EHs对环氧化物底物的两种对映体的区域选择性普遍较差且EHs的分子修饰能够达到完全逆转其区域选择性的案例较少

图1. EHs对外消旋环氧化物的水解作用

因此本文通过计算机辅助设计对来自Rhodotorula paludigena JNU001的环氧化物水解酶(RpEH)的底物结合袋(SBP)内特定残基进行靶向突变并研究了RpEH突变体催化苯乙烯氧化物（SO）进行区域选择性水解的工业应用此外作者通过分子动力学（MD）模拟初步解释了RpEH-I194F对(S)-SO的区域选择性逆转的机制

具体的研究过程如下

①RpEH对外消旋环氧化物(rac-SO)的区域选择性水解作用

利用RpEH的湿细胞催化rac-SO进行水解反应可生成(R)-苯基-1,2-乙二醇转化率为93.6%说明该酶对R构型产物有立体选择性产物ee值为67.8%同时测定了(S)-和(R)-SO的区域选择性系数αS和βR值（计算公式如下[1]）结果表明RpEH具有较高的βR值（90.8%）对(S)-SO区域选择性系数αS值（77.0%）较低

区域选择性系数计算公式
(S)-SO的区域选择性系数用αS和βS表示αS=[Rp/(Rp+Sp)]×100%αS+βS=100%；
 

(R)-SO的区域选择性系数用αR和βR表示αR=[Sp/(Rp+Sp)]×100%αR+βR=100%；

其中Rp和Sp分别表示R型产物和S型产物的浓度

②RpEH突变体的设计构建及筛选
在本文中将RpEH与底物(S)-SO对接通过MD模拟获得1000个对接构像从中分析RpEH的SBP区域残基和(S)-SO之间的相互作用频率频率超过50%的候选突变残基有Tyr331Pro216Ile194和Leu360由于Tyr331是催化活性中心残基Pro216的刚性环状结构对维持β-转角稳定性有重要作用因此最终选择Ile194和Leu360进行定点突变

将194和360位点的残基分别替换为AlaPheIleLeuMetAsnValTrp和Tyr转化至大肠杆菌BL21(DE3)中而后将重组菌体进行培养诱导表达通过RpEH野生型(WT)及突变体酶对rac-SO底物的水解反应最终筛选到了2个较优突变体RpEH-L360V和RpEH-L360F比WT的水解活性分别提高了102%和114.4%（如图2）

图2. RpEH野生型(WT)及突变体酶的水解活性
③RpEH突变体区域选择性的研究
为了探究RpEH突变体对rac-SO的区域选择性在25℃下利用RpEH突变体湿细胞对rac-SO进行12h水解并测定了它们的区域选择系数（αS和βR）结果显示RpEH-L360V对底物rac-SO的转化率高（c>99%）产物(R)-PED的eep值高达84.6%值得关注的是RpEH-I194F对rac-SO的水解生成了相反构型的产物(S)-PED（如表1仅列出比WT活性高的突变体数据）

表1. RpEH野生型(WT)及其突变体对rac-SO的转化率

ee值和区域选择性系数

（表格中带负号的eep值表示生成的产物为S构型）
④突变体RpEH-I194F的区域选择性逆转机理
根据“近攻构象异构体（NAC）”理论 Asp的亲核O原子与环氧化物的亲电Cα或Cβ之间的距离（dα或dβ）对于确定EH区域选择性至关重要因此本文将底物(S)-SO对接到RpEH和RpEH-I194F的SBPs中形成两种不同的EH-环氧化物复合物再通过MD模拟了底物与SBP残基分子间相互作用时的构象变化
结果表明EH-环氧化物复合物RpEH-I194F-(S)-SO的平均dα值大于RpEH-(S)-SO而dβ值小于RpEH-(S)-SO（如图3）说明RpEH中的Asp190亲核残基优先攻击(S)-SO的Cα而RpEH-I194F则优先攻击Cβ

图3. RpEH（左）和RpEH-I194F（右）

分别与底物(S)-SO对接的复合物构象

RpEH-I194F攻击原子的改变是因为在RpEH-I194F-(S)-SO中Ile194被Phe取代改变了邻近Trp191的构象增加了其与(S)-SO的Pi-Pi相互作用的频率这些频繁的分子间相互作用引起了(S)-SO的构象变化使其Cβ原子更靠近亲核Asp190（如图4）从而逆转RpEH-I194F的区域选择性

图4. RpEH和RpEH-I194F与(S)-SO的

分子间相互作用力及底物构象变化
⑤突变体RpEH-L360V和RpEH-I194F的应用实例

由于突变体RpEH-L360V具有较高的αS值（96.9%）而RpEH-I194F具有较高的βS值（98.8%）且均具有较高的催化活性因此将这两个突变体分别应用于底物(S)-1a的区域选择性水解反应以合成手性苯基-1,2-乙二醇（(R)-1b和(S)-1b）具体反应路线如图5

图5. RpEH-L360V和RpEH-I194F对

(S)-环氧化物1a水解的反应路线

同时对突变体RpEH-L360V和RpEH-I194F的放大规模生产条件进行优化最终得到的最佳反应条件如表2RpEH突变体对底物的转化率均达99%以上获得的产物ee值分别为97.2%和97.6%

表2.RpEH-L360V和RpEH-I194F的最佳反应条件及结果

本文总结本文通过对环氧化物水解酶(RpEH)的定点突变以调节突变体的区域选择性最终筛选得到2个突变体RpEH-L360V和RpEH-I194F他们的催化活性高且具有不同的区域选择性将RpEH-L360V和RpEH-I194F分别应用于(R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇的克级合成均获得了大于99%转化率此外本文还通过MD模拟初步分析了突变体RpEH-I194F区域选择性逆转的机制

 

文章来源https://doi.org/10.1016/j.mcat.2024.114451

 

参考文献

[1] 蝴蝶. 宇佐美曲霉环氧化物水解酶的基因克隆分子改造及在手性化合物合成中的应用[D].无锡江南大学, 2017.

 

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